Eine durch Lipid-Wasser-Trennung verstärkte FRET-Sonde zur Detektion der Sauren Sphingomyelinase in lebenden Zellen
Dipl.-Chem. Thomas Pinkert
Institut für Chemie, Humboldt-Universität zu Berlin, Brook-Taylor-Straße 2, 12489 Berlin, Deutschland
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Institut für Chemie, Humboldt-Universität zu Berlin, Brook-Taylor-Straße 2, 12489 Berlin, Deutschland
Search for more papers by this authorDr. Thomas Korte
Institut für Biologie und IRI für Lebenswissenschaften, Humboldt-Universität zu Berlin, Invalidenstraße 42, 10115 Berlin, Deutschland
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Institut für Biologie und IRI für Lebenswissenschaften, Humboldt-Universität zu Berlin, Invalidenstraße 42, 10115 Berlin, Deutschland
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Prof. Dr. Christoph Arenz
Institut für Chemie, Humboldt-Universität zu Berlin, Brook-Taylor-Straße 2, 12489 Berlin, Deutschland
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Institut für Chemie, Humboldt-Universität zu Berlin, Brook-Taylor-Straße 2, 12489 Berlin, Deutschland
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Eine Echtzeit-Beobachtung der Aktivität der Sauren Sphingomyelinase (ASM) ist notwendig zur Aufklärung ihrer Rolle in Lipid-Signaltransduktionsprozessen. Mithilfe von Phosphorodichloridat-Chemie gelang die Synthese von fluoreszierenden Phosphosphingolipiden mit der Fähigkeit zum FRET. Diese Sphingomyelin-Analoga sind Substrate für die rekombinante humane ASM und ermöglichen die Verfolgung der ASM-Aktivität mittels Fluoreszenzspektroskopie. Inkubation mit Zell-Lysaten von Wildtyp- und Knockout-Mäusen zeigte eine ausschließliche Spaltung durch ASM. Darüber hinaus nutzten wir systematisch die Umgebungsempfindlichkeit der Fluorophore, um signifikante Zuwächse in der Responsivität zu erzielen. Die dabei angewendeten Konzepte könnten auch für andere zukünftige Lipase-Sonden zum Einsatz kommen. Eine mikroskopische Abbildung der ASM-Aktivität in lebenden Zellen wurde mittels Zweiphotonenanregung realisiert.
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