Automatisierte Detektion von Proteinphosphorylierung durch Nanoliter-Enzymreaktionen auf Mikroarrays†
Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC Starting Grant nμ LIPIDs, Projekt Nr. 203428) sowie von der Schweizer Kommission für Technologie und Innovation (KTI, Projekt Nr. 13123.1 PFNM-NM) gefördert. Simon K. Küster bedankt sich für das Forschungsstipendium der Schweizerischen Chemischen Industrie (Scholarship Fund of the Swiss Chemical Industry; SSCI). Weiterhin danken wir Tobias Schibli von AB Sciex und Xiangyang Zhang vom MS Service am Laboratorium für Organische Chemie der ETH Zürich. Darüber hinaus möchten wir Konstantin Jefimovs (EMPA Dübendorf, Schweiz) und Fabian Wahl von Sigma-Aldrich für die Unterstützung bei der Entwicklung der Mikroarrays danken.
Abstract
Wir beschreiben eine neue, empfindliche Screening-Methode zur Detektion von Proteinphosphorylierung in komplexen Proteinproben. Der proteolytische Verdau einer Probe wird zuerst mithilfe von nano-Flüssigchromatographie (nano-LC) aufgetrennt, das Eluat wird unmittelbar danach hochfrequent in Mikrotröpfchen kompartimentiert und schließlich auf eine Mikroarray-MALDI-Platte abgelegt. Nach Aufbringen eines Ölfilms werden pL-Tröpfchen einer Phosphataselösung zu jeder zweiten Fraktion auf der Mikroarray-Platte hinzugefügt. Dies induziert in den Fraktionen eine Verschiebung der Massen der phosphorylierten Peptide um n×−80 Da und führt somit zu einem Zickzackprofil des chromatographischen Peaks. Zur Identifizierung wird nun die MALDI-MS-Spur der gesamten Trennung von einem Matlab-Skript auf diese induzierten chromatographischen Peakmuster hin untersucht, wodurch auch Phosphopeptide von sehr geringer Intensität erkannt werden. Die hier vorgestellte Screening-Methode verwendet keine Peaklisten und es bedarf auch keiner umfangreichen MS/MS-Experimente.
