Synthese ortsspezifisch konjugierter IFN-Polymer-Konjugate

Die rekombinante Herstellung des humanen, IFN-α2a erfolgte mit der nichtproteinogenen Aminosäure N⁶-((2-Azidoethoxy)carbonyl)-L–Lysin (NAEK) mittels Amber Stop-Codon Technologie, welche ein Lysin des Wildtyps an Position K31 ersetzte (Abbildung 1, S1).^{8, 15a} Position K31 wurde dann mit BCN oder DBCO modifiziertem Polyethylenglykol, Poly(2-oxazolin) oder Polyglycerol umgesetzt, wodurch Konjugate mit äquivalenter Bioaktivität in vitro und in vivo erhalten wurden.^{8, 15a} In dieser Arbeit haben wir so zur quantitativen LiP-MS-basierten Strukturanalyse sechs verschiedene IFN-Biokonjugate synthethisiert: PEG (10 kDa), LPG (10 kDa oder 11.7 kDa) und POX (PetOx; 7.8 kDa oder 8.6 kDa), jeweils konjugiert mittels kupferfreier Azid-Alkin-Cycloaddition unter Verwendung von am Polymer befindlichen Cyclooctinlinkern, DBCO und BCN. Die Reinheit der hergestellten Konjugate wurde mittels SDS-PAGE analysiert (Abbildung S1).

Quantifizierung des LiP-MS-basierten Proteinverdaus mit Proteinase K

LiP-MS wird zur Detektion struktureller Veränderungen in komplexen Proteomen z. B. als Antwort auf externe Stimuli verwendet.²² Hierzu wird zumeist die unspezifische Protease Proteinase K genutzt.²³ Die Anwendbarkeit dieser Protease für IFN-Biokonjugate wurde in dieser Studie mittels LiP-MS getestet. Als Voraussetzung für eine vergleichende Quantifizierung wurde dem Proteinverdau ein interner Standard (IFN-WT) zugegeben, der ¹⁵N-markiert war (Abbildung 1A).

¹⁵N-IFN-WT wurde rekombinant durch metabolische Markierung mit Ammonium-¹⁵N-Chlorid-Substitution hergestellt und das aufgereinigte Protein wurde über Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese charakterisiert (SDS-PAGE), wobei es eine vergleichbare Auftrennung zum IFN-WT (¹⁴N-IFN-WT) zeigte (Abbildung S1). Die Markierungseffizienz in ¹⁵N-IFN-WT, quantifiziert mittels MS, war 99.6 % (Tabelle S1).

Zunächst wurde der Verdau durch Proteinase K von ¹⁴N-IFN-WT und seinem ¹⁵N-Isotop in einem 1 : 1-Verhältnis durchgeführt (Abbildung 1B). Wie erwartet ergab sich ein konsistentes Bild zwischen ¹⁴N- und ¹⁵N-IFN-WT bezüglich des zeitlichen und quantitativen Verlaufs detektierter Peptide (Abbildung 1C, Tabelle S2). Jede Peptidvariante wurde der ¹⁵N-markierten IFN-Struktur zugeordnet, was zu einer Sequenzabdeckung von über 90 % nach 3 min Verdau durch Proteinase K führte (Abbildung 1C). Das Verhältnis des Verdaus in Helices und Schleifen war über die Zeit vergleichbar zwischen beiden IFN-Varianten (Abbildung S2). Basierend auf diesen konsistenten Ergebnissen nutzen wir nachfolgend ¹⁵N-IFN-WT als internen Standard. Danach verdauten wir ¹⁴N-IFN-DBCO-PEG parallel mit ¹⁵N-IFN-WT mit Proteinase K für 30 min und analysierten die resultierenden Peptide (Abbildung 1D). Die Kartierung des generierten Peptid-Pools des internen Standards ¹⁵N-IFN-WT auf der 3D-Struktur von IFN zeigte eine reduzierte Sequenzabdeckung von 60 % nach 3 min Verdau mit Proteinase K. Ebenfalls nahm die Geschwindigkeit des Verdaus ab (~90 % nach 10 min), verglichen mit dem Verdau des unkonjugierten ¹⁴N-IFN-WT (~90 % nach 1 min) (Tabelle S2). Das durch ¹⁵N-IFN-WT gewonnene LiP-MS-Profil deutet auf eine durch PEG reduzierte Proteinase K-Aktivität hin. Der Mechanismus der Inhibition hängt offenbar nicht mit der Konjugation des Polymers am IFN zusammen, sondern könnte auf die zunehmende Konzentration löslichen PEGs während des proteolytischen Verdaus zurückzuführen sein. Ähnliche Befunde des hemmenden Effektes von PEG auf die Aktivität von Proteasen wurden in der Vergangenheit beobachtet.²⁴ Obwohl Proteinase K zuvor für die LiP-basierte Strukturanalyse verwendet wurde (bspw. für apo-Myoglobin²⁵) erwies sich Proteinase K für unsere strukturelle LiP-Analyse von PEGylierten Biokonjugaten durch die mögliche Polymerinteraktion als ungünstig.

Fingerprinting molekularer Interaktionen zwischen IFN und seinem hochaffinen Rezeptor (IFNAR2) mittels trypsinbasierter LiP-MS

IFN ist unter physiologischen Bedingungen geladen (pI=6.8) und hat 20 über seine Proteinoberfläche gleichmäßig verteilte positiv geladene Aminosäuren (R und K, Abbildung 2A). Daher ist das Protein für einen Trypsin basierten LiP-MS-Verdau geeignet. Die Aktivität von Trypsin wird durch PEG in PEGylierten Proteinen nicht beeinflusst²⁶ und die Konformation des IFN wird durch Bindung an IFNAR2 nicht beeinträchtigt²⁷ – beides ideale Voraussetzungen für unseren ¹⁵N-IFN-WT-basierten Quantifizierungsansatz (Abbildung S3). Wir etablierten LiP-MS, indem wir die spezifischen Interaktionen von IFN mit seinem endogenen hoch-affinen Rezeptor IFNAR2 als Ausgangspunkt weiterer Experimente wählten. Durch Trypsinverdau und nachfolgender MS-Analyse gelangten wir zu einem Interaktionsprofil des IFN-Rezeptorkomplexes, welches mit einer publizierten ¹H NMR -Struktur abgeglichen wurde.²⁷

Die Kinetik des Auftretens tryptischer Peptide des ¹⁴N-IFN-WT-IFNAR2-Komplexes wurde in einem molaren 1 : 5-Verhältnis untersucht und nach 10, 30, 60, 120 und 150 min analysiert. Dann wurden die Peptidfragmente aus einem Trypsinverdau von ¹⁵N-IFN-WT nach 150 min jeder Probe des ¹⁴N-IFN-WT-IFNAR2-Komplexes als interner Standard hinzugefügt und eine MS-Analyse durchgeführt (Abbildung 2B). In diesem Falle entschieden wir uns die Peptidfragmente nach 150 Minuten als interne Kontrolle und nicht für eine gleichzeitige Inkubation von ¹⁵N-IFN-WT mit dem IFNAR2 und intaktem ¹⁵N-IFN-WT, da es dadurch zu einem Ligandenaustausch gekommen, und die Analyse unmöglich gewesen wäre (diese Einschränkung galt nicht für die Polymer-IFN-Biokonjugate; siehe unten). Die mittlere Anzahl identifizierter Peptide, das mittlere totale extrahierte Ionenchromatogramm (XIC) der ¹⁴N- und ¹⁵N-Peptide, sowie die Intensitäten der Peptide mit ungeschnittener Trypsin-Schnittstelle über die Zeit hinweg sind in Abbildung S4–S6 dargestellt. Die Quantifizierung von Schnittstellen des ¹⁴N-IFN-WT-IFNAR2-Rezeptor-Komplexes, beschrieben durch t-Statistik (Signifikanzniveau bei α=0.05, entsprechend einem t-Wert von 4.303), zeigte auf, dass die Proteolyse in Abhängigkeit der lokalen Proteinstruktur erfolgte (Abbildung 2C, S7). Die N- und C-terminalen α-Helices (Aminosäuren 10–21 und 137–157) von IFN sind im IFNAR2 Komplex geschützt^{27, 28} und unsere Experimente bestätigten dies (Positionen R12 und R22). Die negativen t-Werte an diesen beiden Positionen zeigten, dass Trypsin nicht an der IFN-IFNAR2 Interaktionsfläche schneiden konnte (Abbildung 2D). Diese Beobachtung wird durch die unveränderte Schneidrate an R12 bestätigt (Abbildung 2E). Gleichzeitig blieben die Intensitäten (und t-Werte) an der Schnittstelle K70 über das analysierte Zeitintervall hinweg ähnlich ausgeprägt (Abbildung 2F). Wir vermuten, dass die Umgebung der K70-Schnittstelle weniger zugänglich für Trypsin ist. Einige Schnittstellen (z. B. R120), die nicht an der Bindung mit IFNAR2 beteiligt sind, wurden zugänglicher für den Trypsinverdau (Abbildung 2C, 2G). Ein ähnliches Muster wurde für die benachbarte Schnittstelle K112 beobachtet (Abbildung 2C). Beide Stellen sind in der α-Helix D lokalisiert (Aminosäuren 110–132). R162 im Bereich der C-terminalen Helix wurde ebenfalls schnell geschnitten, erkennbar an einem positiven t-Wert nach 10 min des Verdaus und einer Reduktion der Intensität über die Zeit hinweg (Abbildung 2H). Diese Schnittstelle ist direkt am Randbereich der IFN-IFNAR2 Interaktionsfläche lokalisiert (Abbildung 2D). Zusammengefasst konnten also interagierende und nicht interagierende Bereiche innerhalb des IFN-IFNAR2-Komplexes mithilfe unseres LiP-MS-Ansatzes erfolgreich abgegrenzt werden.

Fingerprinting von Polymer-Protein-Interaktionen in IFN-Polymer-Konjugaten

Nach der Bestätigung unseres LiP-MS-Ansatzes mittels des oben beschriebenen IFN-IFNAR2 Komplexes, kartierten wir nun die Interaktionen zwischen IFN und Polymeren in IFN-Polymer-Konjugaten. Dazu synthetisierten wir IFN-Konjugate mit verschiedenen Polymeren unterschiedlicher Hydrophilie (POX weniger hydrophil als PEG; LPG am hydrophilsten) und begannen mit drei Varianten ortsspezifisch konjugierter ¹⁴N-IFN-DBCO-Polymer-Konjugate zur strukturellen Analyse mittels trypsinbasierter LiP-MS (Abbildung 3A). Der interne Standard ¹⁵N-IFN-WT wurde nun von vornherein zum ¹⁴N-IFN-Polymer-Konjugat in einem molaren 1 : 1-Verhältnis hinzugegeben (gemeinsamer Verdau des ¹⁵N-IFN-WT und ¹⁴N-IFN-Polymer-Konjugates) und erste Proben wurden nach 10 min gezogen, die letzten Proben nach 150 min (Abbildung 3B). Zusätzlich wurde die Mutante ¹⁴N-IFN-K31N₃ nach 60 min und 150 min analysiert. Die mittlere Anzahl identifizierter Peptide, das Ionenchromatogramm (XIC) der ¹⁴N- und ¹⁵N-Peptide, sowie die Intensitäten der Peptide mit ungeschnittener Trypsin-Schnittstelle sind für jedes DBCO-Konjugat in den Hintergrundinformationen dargestellt (Abbildung S8–S13).

Die Signifikanzen der quantifizierten Schnittstellen innerhalb der Sequenz jedes ¹⁴N-IFN-Polymer-Konjugats sind in Abbildung 3C–G als t-Statistik dargestellt (4.303; Signifikanzlevel α=0.05). Die p-Werte für die Schnittstellen sind in Abbildung S14 gezeigt. Wir wählten fünf signifikante Schnittstellen aus, um Ähnlichkeiten und Differenzen zwischen den Konjugaten über die Zeit hinweg zu illustrieren (Abbildung 3J–N). Zunächst analysierten wir die Konjugationsstelle K31, an der PEG, LPG, und POX an IFN gekoppelt wurde (Abbildung 3J). Wie erwartet war K31 nicht mehr für den Trypsinverdau der ¹⁴N-IFN-Polymer-Konjugate verfügbar, wohl aber im Falle des unmodifizierten ¹⁴N-IFN-WT. Durch den Austausch von K31 mit der nichtproteinogenen Aminosäure NAEK erhöhte sich der Trypsinverdau an Position R33. Dies kann dadurch begründet werden, dass der Verdau an dieser Schnittstelle nicht messbar war, wenn bereits eine Proteolyse an Position K31 erfolgt war. Die Modifikation von ¹⁴N-IFN-K31N₃ mittels Polymerkonjugation hatte keinen Effekt auf den Trypsinverdau in der benachbarten Umgebung der Schleife (R33; Abbildung 3K). Diese Beobachtung, zeigt, dass die kovalent gebundenen Polymere hochflexibel sind und dadurch das Protein nicht einmal im Bereich der Konjugation vor dem proteolytischen Verdau schützen können.

Im Folgenden untersuchten wir den Verdau innerhalb verschiedener Umgebungen auf der Proteinoberfläche: K131 (Helix) und K49 (Schleife) (Abbildung 3L, Abbildung 3M).

Beide Lysine sind durch Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert.²⁷ Die Quantifizierung des Verdaus an der Schnittstelle K131 (Helix) zeigte eine Reduktion der Intensität ab 30 min für ¹⁴N-IFN-DBCO-LPG und ¹⁴N-IFN-DBCO-POX, nicht jedoch für ¹⁴N-IFN-DBCO-PEG.

Ein deutlicher Rückgang des Trypsinverdaus an der Schnittstelle K49 (Schleife) wurde in allen untersuchten DBCO-Konjugaten ab 60 min gefunden (Abbildung 3M). Der Effekt war am deutlichsten beim ¹⁴N-IFN-DBCO-PEG, was mit der bevorzugten Interaktion von PEG mit solvenszugänglichen Lysinen und Argininen aus vorherigen Modellierungen übereinstimmte.⁸ Schließlich untersuchten wir den Verdau an Stelle R120 (Helix). Der Verdau war erhöht für alle ¹⁴N-IFN-DBCO-Polymer-Konjugate, ersichtlich aus den ¹⁴N-¹⁵N-Intensitäten über die Zeit (Abbildung 3N). Der Effekt war am stärksten im Falle von ¹⁴N-IFN-DBCO-POX und weniger intensiv für ¹⁴N-IFN-DBCO-PEG, mit signifikanten Unterschieden für alle IFN-Polymer-Konjugate nach 120 min. Dies deutet auf einen destabilisierenden Effekt der Polymer-Konjugation für all DBCO-Varianten in dieser Schleifenregion (K49) hin, in der absteigenden Reihenfolge POX, LPG und PEG.

Um globale Effekte der Polymer-Konjugation zu charakterisieren, wurde das Verhältnis tryptischer Peptide in Helices und Schleifen für alle ¹⁴N-IFN-DBCO-Polymer-Konjugate und ¹⁴N-IFN-K31N₃ und ¹⁵N-IFN-WT zeitabhängig quantifiziert (Abbildung S15, S16). Im Gegensatz zur Proteolyse von ¹⁵N-IFN-WT führte der Verdau aller ¹⁴N-IFN-DBCO Polymer-Konjugate sowie der Mutante ¹⁴N-IFN-K31N₃ zu einer vermehrten Anzahl tryptischer Peptide in helikalen Bereichen zu frühen Messzeitpunkten (10, 30 min) und zu solchen aus unstrukturierten Schleifen zu späteren Zeitpunkten (120, 150 min).

DBCO wird in der Click-Chemie für kupferfreie Azid-Alkin-Cycloreaktionen genutzt. Der Linker erhöht die Lipophilie und hat den Nachteil, dass regioisomere Addukte auftreten.²⁹ Um den Effekt zu beurteilen, wiederholten wir die LiP-MS-Analyse mit Biokonjugaten, welche anstelle des DBCO-Linkers mit einem weniger hydrophoben BCN-Linker synthetisiert wurden, welcher zudem aufgrund seiner planaren Symmetrie keine Regioisomere ausbildet (Abbildung 4A). Die Intensität der identifizierten Peptide und das Ionenchromatogramm (XIC) der ¹⁴N- und ¹⁵N-Peptide sind für alle BCN-Konjugate in den Hintergrundinformationen aufgelistet (Abbildung S17–S19). Jede Trypsin-Schnittstelle wurde zunächst auf signifikante Unterschiede zwischen Biokonjugat und internem Standard für die Zeitpunkte 60 und 150 min überprüft und die zugehörigen t-Werte bestimmt (4.303; Signifikanzlevel α=0.05; Abbildungen 4B, C; p-Werte in Abbildung S20). Der prozentuale Anteil des Trypsinverdaus in Schleifen und Helices ist in Abbildung S21 dargestellt. Wie auch bei den DBCO-Konjugaten, stand die modifizierte Konjugationsstelle K31 nicht mehr für einen Verdau zur Verfügung, da an dieser Stelle die unnatürliche Aminosäure das Lysin ersetzt (Abbildung 4D). In der Folge konnte ebenso wie beim DBCO-Linker nun auch für den BCN-Linker beobachtet werden, dass die Proteolyse an der benachbarten Position R33 in allen BCN-Polymer-Konjugaten und der Mutante ¹⁴N-IFN-K31N₃ im Vergleich zum WT erhöht war (Abbildung 4B, C, E). Unterschiede zwischen den DBCO- und BCN-Konjugaten wurden an K49 and R120 nach Trypsinverdau gefunden, nicht aber zwischen den verschiedenen Polymeren, die zur Herstellung der BCN-Konjugate verwendet wurden. Das lässt vermuten, dass für alle Polymere ähnliche Dynamiken der Interaktion mit der Proteinoberfläche in dieser Region vorliegen könnten. Wir vermuten, dass die Konformationen der ¹⁴N-IFN-BCN-Polymer-Konjugate einer homogeneren Verteilung als im Falle der DBCO-Konjugate folgen.

In vorhergehenden Studien beobachteten wir geringe Unterschiede in der Schmelztemperatur T_m der DBCO/BCN-Konjugate mit POX im Vergleich zu PEG/LPG (Δ 2.7 °C), jedoch nicht bzgl. deren Aktivität.⁸ Im hier verwendeten LiP-MS-Ansatz konnten wir diese Beobachtungen nicht bestätigen, da dieser neue Datensatz keine strukturellen Unterschiede zwischen den IFN-Polymer-Konjugaten vermuten ließ, die die in vorhergehenden Studien gefundenen Unterschiede der T_m erklären könnten. Betrachtet man diese Datensätze nun gemeinsam, kann vermutet werden, dass die unterschiedlichen T_m als Folge rascher und lediglich vorübergehend vorliegender aber eben auch destabilisierend wirkender Polymer-IFN-Interaktionen aufzufassen sind und nicht auf spezifische, anhaltende Bindungen zwischen dem IFN und den Polymeren zurückzuführen sind, die mittels LiP-MS gefunden worden wären (z. B. Schnittstelle R120; ¹⁴N-IFN-DBCO-POX, see above).

Im Folgenden untersuchten wir, ob zwischen den verwendeten Polymeren und Linkerstrukturen signifikante Unterschiede bestehen (Abbildung 5A, B). Auffallend verhielten sich die POX-Konjugate, bei denen die meisten Schnittstellen mit Trypsin im Vergleich zu LPG- oder PEG-Konjugaten gefunden wurden. Das lässt vermuten, dass die hydrophilen Polymere PEG und LPG aber nicht POX ein ähnliches Wechselwirkungsmuster mit der IFN-Oberfläche haben. Diese Ergebnisse aus den LiP-MS-Experimenten wurden weiterhin mit atomistischen Molekulardynamiksimulationen der IFN-DBCO-Polymer-Konjugate untersucht (Abbildung 5C).⁸ Wir orientierten uns dabei an Studien anderer, die die maximale Aufenthaltszeit von PEG mit einzelnen Aminosäuren auf der Oberfläche des Albumins untersuchten.³⁰ Insgesamt lassen diese Modelle vermuten, dass die Polymer-IFN Interaktionen lediglich vorübergehend sind und auch von kurzer Dauer, da diese zumeist nicht länger als 50 ns andauern. Auch hier fällt das POX-Konjugat im Vergleich zu den hydrophileren Polymeren aus der Reihe, mit insgesamt kürzeren Aufenthaltszeiten an der Proteinoberfläche. Die Ergebnisse dieser in silico Modellierung sind im Einklang mit der oben berichteten Beobachtung aus den LiP-MS Messungen, die ebenfalls eine bessere Umsetzung der POX-Konjugate durch Trypsin vermuten lassen (Abbildung 5A). Außerdem konnten wir feststellen, dass die Polymere mit unterschiedlichen Aminosäuren auf der Proteinoberfläche bevorzugt interagierten. Während PEG Lysine und Arginine bevorzugte, waren dies Aspartat und Glutamat im Falle des LPG, wahrscheinlich zurückzuführen auf die Wasserstoffbrücken, die sich zwischen den Hydroxylgruppen von LPG zu Aspartaten und Glutamaten ausbilden können. Die Carbonylgruppen des POX interagierten mit Aminosäuren, die als Donor von Wasserstoffbrücken fungieren, insbesondere das hydrophobe Tryptophan (Abbildung 5C). Auch die Protein-Polymer-Interaktionsenergien könnten auf eine stärkere Wechselwirkung der hydrophilen Polymere LPG und PEG mit dem IFN hinweisen, als das beim POX der Fall ist (Abbildung 5D). Insgesamt aber bedeckt PEG die größte Proteinoberfläche (Abbildung 5E).

Abschließend versuchten wir, die unterschiedlichen Polymerinteraktionen vor allem des POX im Vergleich zum PEG oder LPG mit Bindungsdaten des IFN-IFNAR2 Rezeptors in Bezug zu setzen. Die SPR-Sensorgramme bestätigten die hohe Affinität des IFN zum IFNAR2 Rezeptor, genauer gesagt dessen Ektodomäne, die für diese Versuche verwendet wurde und im nanomolaren Bereich bindet (K_D von ca. 7–8 nM; Abbildung S22, Tabelle S3). Die Ligand-Rezeptor-Ektodomänen-Interaktion folgte einer raschen Assoziations-Dissoziations-Kinetik, mit einer Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten k_on von (2.5±0.5)×10⁶ M⁻¹ s⁻¹ und einer Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten k_off von (1.8±0.1)×10⁻² s⁻¹. Die Dissoziationsgleichgewichtskonstante (K_D=k_off/k_on), wurde durch eine Analyse des konzentrationsabhängigen Bindungssignals (R_max-Werte) bestätigt – hierbei wurden ähnliche Bindungsaffinitäten von 7–9 nM erhalten. Die Polymerkonjugate des IFN hatten grundsätzlich bis zu 2-fach reduzierte Bindungsaffinitäten. Diese Reduktion war Folge einer reduzierten Assoziationskinetik; die Dissoziationskinetik war bei den Polymerkonjugaten im Vergleich zum unkonjugierten Wildtyp 1.5-fach erhöht. Die langsamere Assoziation der Polymer-IFN-Konjugate im Vergleich zum unmodifizierten Wildtyp ist im vorliegenden Falle vermutlich ebenfalls die Folge eines größeren hydrodynamischen Radius, wie an anderer Stelle berichtet.¹⁵ Dieser größere hydrodynamische Radius sollte die Diffusion des Polymer-IFN Konjugats verlangsamen. Wir interpretieren diese Daten in der Zusammenschau so, dass die Veränderungen der Bindungskinetik der Konjugate im Vergleich zum unmodifizierten Wildtyp mit dem Rezeptor vermutlich Folge der veränderten Moleküldimensionen sind, nicht aber ein verändertes Interaktionsverhalten, beispielsweise durch ein Abdecken der Interaktionsfläche des IFN durch ein Polymer, widerspiegeln.

Im Ergebnis ermöglichen derartige LiP-MS-Untersuchungen einen spannenden Einblick in das dynamische Wechselspiel von Protein-Polymer-Biokonjugaten. Der Ansatz erlaubt es, globale Effekte der Polymer-Protein-Interaktionen in helikalen und unstrukturierten Schleifenbereichen abzugrenzen und spezifische Effekte einzelner Polymerklassen, hier untersucht für PEG/LPG/POX, zu verstehen. Allgemein sind diese Interaktionen der Polymere mit der Proteinoberfläche kurzlebig und schwach und kontrastieren dahingehend die spezifischen Protein-Protein-Interaktionen, wie wir sie für den IFN/IFNAR2-Komplex gefunden haben (siehe oben).

Zukünftige Studien sollten einige Limitierungen unserer Experimente aufgreifen. So nutzen wir beispielsweise lediglich Trypsin für die LiP-MS-Untersuchungen. Es gibt aber keinen Grund, wieso man diese Protokolle nicht auf andere spezifische Proteasen ausweiten sollte, beispielsweise in der Absicht, vor allem die Interaktionen der hydrophoberen Proteinoberflächen mit Polymeren zu verstehen. Solche erweiterten „Protease-Bibliotheken“ könnten besonders für hydrophobere Polymere hilfreich sein.