Mechanische Verstärkung von Coiled Coils mit Lactam und Histidin-Metall-Klammern

Coiled Coils (CCs) sind in der Natur vorkommende superhelikale Proteindomänen, die beispielsweise in Transkriptionsfaktoren vorkommen oder als mechanische Bausteine in der extrazellulären Matrix und im Zytoskelett essentielle Aufgaben erfüllen.¹ CCs bestehen aus zwei bis sieben α-Helices. Sie besitzen eine hoch repetitive Sequenz von sieben Aminosäuren (Heptade), in der die einzelnen Positionen auch mit abcdefg bezeichnet werden (Abbildung 1 A).² In den Positionen a und d befinden sich vorrangig hydrophobe Aminosäuren, die den hydrophoben Kern des CCs darstellen. Geladene Aminosäuren in den Positionen e und g bilden ionische Wechselwirkungen aus. Die Aminosäuren in den Lösungsmittel-exponierten Positionen b, c und f sind gut für Modifikationen geeignet, da sie die Gesamtstruktur von CCs kaum beeinflussen.³ Synthetische CCs und strukturell ähnliche helikale Moleküle können als Gerüststruktur für Kondensationsreaktionen⁴ oder für den Transfer funktionaler Gruppen⁵ verwendet werden. Des Weiteren werden CCs erfolgreich zur Entwicklung molekularer Schalter zur Detektion von Rezeptorbindung⁶ oder einer Änderung der Ionenstärke⁷ eingesetzt. Mechanische Eigenschaften sind wichtig für die Entwicklung und Anwendung von CCs als molekulare Bausteine in Hydrogelen,⁸ Protein-Origami Strukturen,⁹ künstlichen Membranfusionsdomänen¹⁰ und molekularen Kraftsensoren.¹¹ Um die mechanischen Eigenschaften von CCs gezielt zu kontrollieren und zu optimieren, ist ein grundlegendes Verständnis der mechanischen Struktur-Funktionsbeziehungen unverzichtbar. Vor kurzem wurde gezeigt, dass die Helixpropensität der Lösungsmittel-exponierten Aminosäuren die mechanische Stabilität eines CCs Heterodimers unter Krafteinwirkung in Schergeometrie beeinflusst.¹² Mittels Molekulardynamiksimulationen konnte darüber hinaus visualisiert werden, dass CC-Heterodimere und Heterotimere auf Scherkräfte mit Helixentfaltung an den Kraftangriffspunkten reagieren.¹³ Simulationen mit fixierten, α-helikalen Dihedralwinkeln führten hingegen zur Dissoziation der intakten Helices. Die Dissoziation der Helices trat hier schon bei einer geringeren Deformation auf, erforderte jedoch höhere Kräfte.^13b In diesem Artikel wird experimentell untermauert, dass eine Stabilisierung von Helixwindungen durch makrozyklische Klammern (Abbildung 1) hoch effektiv ist, um die thermodynamischen und mechanischen Eigenschaften von CC-Heterodimeren gezielt zu verstärken.

Das Klammern von Peptiden ist eine fest etablierte Methode, um eine stabile α-helikale Struktur in Peptiden zu induzieren.^{14, 15} Als Klammer eignen sich ionische Wechselwirkungen (z. B. Glu-Lys¹⁶), Metall-Koordinationsbindungen (z. B. His-[Metall]^2+[17]) oder auch kovalente Bindungen.^{14, 15, 18} Um eine Helixwindung effektiv zu stabilisieren, werden die beteiligten Aminosäuren häufig in einem i→i+4 Abstand eingefügt.^{14c, 15a, 15e-17, 18b, 18d, 18f, 18g} Ursprünglich wurden geklammerte Peptide zur Erforschung der Nukleation, Faltung und Stabilität von α-Helices entwickelt.^{16, 17, 18} Inzwischen werden geklammerte Peptide zur Medikamentenentwicklung eingesetzt, da die lokale Stabilisierung der helikalen Struktur die Bindung an das Zielmolekül und die Resistenz gegenüber Proteasen erhöht.^{3a, 3c, 15b-15d} In einigen Fällen wurde auch eine Verbesserung der Zellpenetration beobachtet.^{15b, 15d} Während die Effekte von Helixklammern bei singulären Helices gut untersucht sind, wurde diese Methode bei Helixbündeln bisher nur selten eingesetzt. Einige wenige Beispiele zeigen eine thermodynamische Stabilisierung von CCs^{3, 8d, 10, 18c, 18e, 19} und Helixbündeln²⁰ durch makrozyklische Klammern. Dieser Artikel zeigt, dass durch gezieltes Einfügen von Klammern auch die mechanische Stabilität von CCs erhöht werden kann. Dazu wurde eine kovalente Lactam-Klammer in ein CC-Heterodimer eingefügt und der Effekt der Klammer mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM)-basierter Einzelmolekülkraftspektroskopie untersucht. Die Position der Klammer wurde relativ zum Kraftangriffspunkt variiert (Abbildung 1), um die jeweiligen Auswirkungen auf die thermodynamische und mechanische Stabilität des CCs im Detail zu ermitteln. Des Weiteren wurde die kovalente Lactam-Klammer durch eine reversible His-Ni²⁺-His Koordinationsklammer ersetzt. Dies ermöglichte es, den Effekt der mechanischen Belastung auf den Entfaltungsprozess auf molekularer Ebene zu untersuchen.

Als Modellsystem wurde ein gut charakterisiertes CC-Heterodimer (A₄B₄) verwendet (Abbildung 1). A₄B₄ besitzt eine hohe thermodynamische Stabilität (T_m=81 °C und K_D <1.0×10⁻¹⁰ M bei 20 °C²¹) und eine niedrige Dissoziationsrate (k_off=3.2×10⁻⁴ s⁻¹ bei 25 °C^13a). Trotz der hohen Stabilität weist A₄B₄ einen Abschnitt mit geringer Helixpropensität am C-Terminus von A₄ auf²² (Abbildung S1). Um die Stabilität des CCs zu erhöhen, wurde in den Lösungsmittel-exponierten b und f Positionen am C-Terminus von A₄ (A_4x) eine kovalente Lys_i→Asp_i+4 Lactam-Klammer eingefügt^{14g, 18d} (Abbildung 1 B; Abbildung S2, S3). Im Vergleich zu N-terminalen Klammern zeigen C-terminale Klammern einen größeren Effekt auf die Helixnukleation und die thermodynamische Stabilität.^{10, 18f} Das geklammerte CC wurde mechanisch in der Schergeometrie untersucht. Dazu wurden der geklammerte C-Terminus von A_4x und der N-Terminus von B₄ als Kraftangriffspunkte gewählt und entsprechend ein Cys zur Immobilisierung eingefügt²³ (Abbildung 1). Es wird erwartet, dass die Klammer in A_4XB₄ den größten Effekt auf die mechanische Stabilität hat, da der Terminus mit der geringsten Helixpropensität direkt am Kraftangriffspunkt geklammert ist. Daher ist dort eine erhöhte Resistenz gegen Helixentfaltung und eine Separation der Stränge zu erwarten. Um die Designprinzipien für Helix-Klammern im Modellsystem genauer zu untersuchen, wurde zudem eine Lactam-Klammer am C-Terminus von B₄ eingefügt (Abbildung S4, S5), während die Angriffspunkte der Kraft unverändert blieben (A₄B_4X). Des Weiteren wurde das System A_4XB_4X untersucht, um mögliche synergistische Effekte zu ermitteln. Schließlich wurde die kovalente Lactam-Klammer an der b und f Position der C-terminalen Heptade von A₄ durch eine reversible His-Ni²⁺-His Klammer^{8d, 17a, 17b} ersetzt (A_4HB₄, Abbildung 1 B, Abbildung S6).

Zunächst wurde die Struktur und die thermodynamische Stabilität der einzelnen geklammerten und nicht geklammerten CC-formenden Peptide, sowie der CC-Heterodimere, mittels Zirkulardichroismus (CD) Spektroskopie untersucht. Die geklammerten Peptide A_4X und B_4X zeigten eine höhere Helizität (88 % und 85 %) als die nicht geklammerten Peptide A₄ und B₄ (31 % und 65 %, Abbildung S7A). Das größtenteils ungefaltete A₄ besitzt ein Minimum bei 205 nm, während das geklammerte A_4X die für eine α-Helix typischen Minima bei 208 nm und 222 nm zeigt. B₄ wies die typischen Minima für α-helikale CCs auf, was auf eine Homodimerisierung hindeutet.^{8c, 21} Die Tendenz zur Homodimerbildung wurde durch die C-terminale Klammer in B_4X weiter erhöht. Das Einfügen der Lactam-Klammern erhöhte zudem die Helixstabilität der CCs (Abbildung 2 A). Für das nicht geklammerte Referenz-CC A₄B₄ war das Verhältnis der gemittelten molaren Elliptizität pro Aminosäure [Θ]_MRE bei 222 nm und 208 nm >1 (Tabelle 1). Dies deutet auf die Bildung einer stabilen CC Struktur hin.²⁴ Bei 23 °C betrug die Erhöhung der Helizität des CCs 4 %, wenn die Lactam-Klammer nur in Peptid A oder B eingefügt wurde, während eine Kombination der Klammern zu einer Erhöhung von 8 % führte. Die Lactam-Klammer führte auch zu einer Erhöhung der thermodynamischen Stabilität. Bei CCs mit einer Klammer wurde ein Anstieg der Schmelztemperatur T_m von 77 °C (A₄B₄) auf 81 °C (A_4XB₄) bzw. 83 °C (A₄B_4X) festgestellt (Tabelle 1, Abbildung S10, Tabelle S1). Wenn beide Helices eine Lactam-Klammer besaßen (A_4XB_4X), stieg T_m von 77 °C auf >95 °C an. Dies deutet darauf hin, dass der stabilisierende Effekt mehr als additiv ist. Die reversible His-Ni²⁺-His Klammer in A_4H führte zu einem Anstieg der Helizität um ≈10 % (Abbildung S8A). Nichtdestrotz, war die Helizität und die T_m des Ni²⁺-koordinierenden CCs A_4HB₄ nicht höher als die des Referenz-CCs A₄B₄ (Abbildung 2 B, Tabelle 1, Abbildung S10). Während für alle Messungen von A_4HB₄ nicht-koordinierende PIPPS-gepufferte Salzlösung (PIPPS-BS) verwendet wurde, wurden die Lactam-geklammerten CCs in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gemessen. Die T_m des Referenz-CCs A₄B₄ unterschied sich in beiden Puffern nur wenig (Tabelle 1, Abbildung S9 und S10).

Um die mechanische Stabilität der geklammerten CCs zu untersuchen, wurde Einzelmolekülkraftspektroskopie genutzt (Abbildung 1 C). Da die Kraft-induzierte Trennung der CC-Stränge in Schergeometrie von der Kraftladungsrate r=dF/dt abhängt,^{8d, 12, 13} wurden Kraftkurven bei sechs verschiedenen Zuggeschwindigkeiten in jeweils drei unabhängigen Experimenten aufgenommen. Bei einer Zuggeschwindigkeit von 400 nm s⁻¹ zeigen repräsentative Kraft-Abstandskurven (Abbildung S11) und Histogramme der Abrisskraft (Abbildung 3 A), dass alle Lactam-geklammerten CCs eine höhere Abrisskraft aufweisen als das Referenz-CC A₄B₄. Befand sich die Lactam-Klammer direkt am Kraftangriffspunkt (A_4XB₄), erhöhte sich die Abrisskraft um 15 pN (Tabelle S2). Bei Einfügen der Lactam-Klammer in die komplementäre Helix (A₄B_4X) war nur ein Anstieg von 7 pN zu beobachten. Wurden beide Helices geklammert (A_4XB_4X), stieg die Abrisskraft um 13 pN, was vergleichbar mit dem Anstieg bei A_4XB₄ ist. Dies ist ein erstes Anzeichen dafür, dass die kovalente Lactam-Klammer thermodynamisch und mechanisch verschieden wirkt. Eine synergistische mechanische Stabilisierung durch mehrere Klammern konnte nicht beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass die lokale Helixstabilität an den Kraftangriffspunkten für die mechanische Stabilität des CCs essentiell ist.

Zur Ermittlung der Kraft-freien Dissoziationsrate k_off und der Potentialweite Δx wurden zunächst die häufigsten Abrisskräfte F und die entsprechenden Kraftladungsraten r aus den Daten extrahiert (Abbildung S12–S15, Tabelle S2). Das Bell-Evans Modell²⁵ wurde genutzt um die erhaltenen Daten zu fitten (Abbildung 3 B, Tabelle 1). Ein Peacock-Test zeigte, dass sich alle Lactam-geklammerten CCs signifikant vom Referenz-CC A₄B₄ unterscheiden (Tabelle S3, Abbildung S18). Die Lactam-Klammer führte zu einer Verringerung von k_off bei gleichzeitiger geringerer Deformierbarkeit (verringerte Δx). Dieses Ergebnis stimmt mit vorherigen Simulationen von CCs mit fixierten Dihedralwinkeln überein, bei denen höhere Abrisskräfte kombiniert mit geringerer Helixentfaltung beobachtet wurden.^13b Vergleicht man die beiden CCs mit einer Lactam-Klammer (A₄B_4X vs. A_4XB₄) wird deutlich, dass sich die Position der Klammer auf die mechanische Stabilisierung auswirkt. Der stabilisierende Effekt der Klammer war am größten, wenn diese direkt am Kraftangriffspunkt platziert wurde (A_4XB₄). Jedoch hatte auch das Einfügen der Klammer in der komplementären Helix (A₄B_4X) einen messbaren Effekt. Dies deutet auf eine allosterische Übertragung der lokalen Helixstabilität über den hydrophoben Kern hin. Das Einfügen von Lactam-Klammern in beide Helices führte nicht zu einer weiteren Erhöhung der mechanischen Stabilität (Tabelle S3, Abbildung S18). Zusammengenommen verdeutlichen diese Ergebnisse, dass Helix-Klammern unterschiedlich auf die thermodynamische und mechanische Stabilität des Modell-CCs wirken. Während die Erhöhung der thermodynamischen Stabilität nicht von der Position der Klammer im A oder B Peptid abhing, war die mechanische Stabilisierung größer, wenn sich die Klammer direkt am Kraftangriffspunkt befand. Interessanterweise erhöhte die Anwesenheit beider Klammern die thermodynamische Stabilität in synergistischer Art und Weise; jedoch war dieser synergistische Effekt in Bezug auf die mechanische Stabilität unter Scherkraft nicht zu beobachten. Diese Ergebnisse validieren den gewählten Ansatz zur Stabilisierung des ausgewählten Modell-CCs. Jedoch muss davon ausgegangen werden, dass der beobachtete Effekt auch von der Peptidsequenz und der Position der Klammer abhängt. Die hier verwendete Lys_i→Asp_i+4 Lactam-Klammer wurde am C-Terminus eingefügt, da dieser die niedrigste Helixpropensität aufweist (Abbildung S1). Aufgrund ihres Mechanismus der Helixstabilisierung haben Lactam-Klammern auch einen größeren Effekt am C-Terminus als am N-Terminus.^{18f, 18g} Eine Verallgemeinerung der Interpretation, dass die mechanische Stabilität am effektivsten erhöht wird, wenn die Klammer am Kraftangriffspunkt eingefügt wird, ist daher erst möglich, wenn dies auch für weitere Sequenzen sowie N-terminale Klammern gezeigt wird.

Für das hier untersuchte CC stützt die Verringerung von Δx die Hypothese, dass die Entfaltung am C-terminalen Kraftangriffspunkt beginnt; gefolgt von der Dissoziation der teils entfalteten Stränge senkrecht zum Kraftvektor.^13a Das Einfügen der Lactam-Klammer im schwächsten Teil der Helix verschiebt den Ausgangspunkt der Entfaltung in einen anderen, vormals stabileren, Teil der Helix. Die direkte Folge dessen ist die Erhöhung der Energiebarriere der Dissoziation (verringerte k_off), kombiniert mit einer geringeren Deformierbarkeit (verringerte Δx). Um diese Hypothese zu bestätigen und die CC-Bibliothek zu erweitern, wurde die kovalente Lactam-Klammer (Lys_i→Asp_i+4) in A₄ durch eine reversible His-Ni²⁺-His Koordinationsklammer ersetzt (His_i→His_i+4) und so A_4H erhalten. Verglichen mit dem Referenz-CC A₄B₄ erhöhte sich die Abrisskraft von A_4HB₄ in Anwesenheit von Ni²⁺ um ≈7 pN (Abbildung 4 A, Abbildung S16, S17, Tabelle S2). Wie bei der Lactam-Klammer zeigte auch die His-Ni²⁺-His Koordinationsklammer eine Verringerung von k_off, wenn Ni²⁺ hinzugegeben wurde (Abbildung 4 B, Abbildung S19). Anders als bei A_4XB₄ war jedoch bei A_4HB₄ keine Verringerung von Δx im Vergleich zum Referenz-CC A₄B₄ zu erkennen (Tabelle 1, Tabelle S4). Dies zeigt, dass die His-Ni²⁺-His Koordinationsklammer höchstwahrscheinlich unter Krafteinwirkung bricht. Für Ni²⁺-NTA und His₆-Tags wurden Abrisskräfte zwischen 40–300 pN gemessen.²⁶ Bei dem hier untersuchten CC reichen jedoch schon geringere Kräfte aus, da nur eine Imidazol-Ni²⁺ Bindung brechen muss, um die Klammer zu öffnen. Unter Krafteinwirkung wird zum Brechen der reversiblen His-Ni²⁺-His Koordinationsklammer zusätzliche Energie benötigt, so dass k_off verringert ist. Ist die His-Ni²⁺-His Klammer gebrochen, läuft die Entfaltung des CCs wie in Abwesenheit von Ni²⁺ ab. Dieser Interpretationsansatz stimmt mit vorigen Experimenten überein, bei denen His-Ni²⁺-His Koordinationsklammern an beiden Kraftangriffspunkten eingefügt wurden. Auch bei diesen Experimenten wurde eine Verringerung von k_off sowie eine nicht signifikante Änderung von Δx beobachtet.^8d

Zusammenfassend stellt das Einfügen von Klammern eine hocheffektive Strategie dar, um die thermodynamische, kinetische und mechanische Stabilität von CC Heterodimeren zu erhöhen. Der synergistische Effekt auf die thermodynamische Stabilität des CCs konnte jedoch bei mechanischer Belastung nicht festgestellt werden. Berücksichtigt man den schon bekannten Mechanismus zur Trennung der Stränge unter Scherkraft, ist zu vermuten, dass die Kraft zunächst auf den schwächsten Teil der Helix wirkt. Die Stabilisierung dieses Teils der Helix erhöhte die Abrisskraft des CCs und verringerte die Dissoziationsrate um das 10-fache. Eine vergleichbare Erhöhung der Energiebarriere der Dissoziation konnte sowohl bei der Lactam- als auch bei der His-Ni²⁺-His Koordinationsklammer beobachtet werden, jedoch unterscheiden sich die Dissoziationspfade der CCs unter Krafteinwirkung. Die reversible His-Ni²⁺-His Koordinationsklammer brach unter Krafteinwirkung auf und ermöglichte die Entfaltung der Helix vom Kraftangriffspunkt aus. Die kovalente Lactam-Klammer hingegen blieb intakt und erzwang so den Beginn der Entfaltung in einem anderen Teil der Helix. Der Fokus zukünftiger Experimente könnte auf dem mechanischen Stabilisierungseffekt von Klammern in unterschiedlichen Positionen der Helix liegen. Beispielsweise könnten die hier untersuchten C-terminalen Klammern mit N-terminalen Klammern oder mehreren Klammern in der gleichen Helix verglichen werden. Im biologischen Kontext gesehen, deuten die hier gezeigten Ergebnisse an, dass ionische Wechselwirkungen in den i→i+4 Positionen natürlich vorkommender CCs die lokale mechanische Helixstabilität erhöhen. Die Abwesenheit von ionischen Interaktionen in bestimmten Helixabschnitten könnte diese demnach zu sensitiven Sollbruchstellen bei Krafteinwirkung machen. Das Einfügen Helix-induzierender Klammern ist somit eine exzellente Strategie, um die mechanische Stabilität von CCs für vielfältige Anwendungen gezielt zu kontrollieren. Insbesondere reversible Metall-Koordinationsklammern, die in situ geformt werden können, haben ein hohes Anwendungspotential zur Herstellung CC-basierter nanomechanischer Bausteine, die beispielsweise als Vernetzer für biomimetische Hydrogele dienen können.