Totalsynthese, Struktur und biologische Aktivität von Adenosylrhodibalamin, dem unnatürlichen Rhodiumhomologen von Coenzym B₁₂

Die biochemische Aktivität der biologischen Formen von B₁₂ basiert auf der zentralen Rolle des vom Corrinring gebundenen Cobaltzentrums.¹ Warum aber ist Cobalt, im Unterschied zu anderen Metallen, so hervorragend für die Rolle in B₁₂ geeignet?^1b Diese schon früher gestellte Frage ist eine gewaltige Herausforderung.^{1, 2} Um der “Cobalt-Frage” auf den Grund zu gehen, wurde ein Austausch von Cobalt durch dessen schweres Gruppe-IX-Homologes Rhodium angestrebt. Die spezielle Eignung von Coenzym B₁₂ (5′-Desoxy-5′-adenosylcobalamin, AdoCbl; Abbildung 1) als katalytischer Radikalquelle über enzymkontrollierte homolytische Spaltung seiner Co-C-Bindung³ machte das Rh-Homologe 5′-Desoxy-5′-adenosylrhodibalamin (AdoRbl) zu einem interessanten Syntheseziel. AdoRbl wurde zum ersten Mal in den 1970er Jahren über (metallfreies) Hydrogenobalamin hergestellt, das in niedriger Ausbeute in einer Cobalt-freien Chromatium-vinosum-Kultur zugänglich war, wurde damals aber nur unzureichend charakterisiert.^2a Da in der Vergangenheit verschiedene Alternativstrategien zur Herstellung von Metallanalogen natürlicher Corrinoide durch Entfernung von deren Cobalt-Ion keinen Erfolg hatten (siehe z. B. Lit. ⁴), musste eine neue Strategie zur Herstellung von AdoRbl gefunden werden. Wir berichten hier über eine knappe Totalsynthese von AdoRbl mittels strategischer Kombination von biologischen und chemischen Syntheseschritten sowie über seine strukturellen und biologischen Eigenschaften. Die Frage “Warum nicht Rhodium?” ergab auch neue Denkanstöße zur fundamentalen Problematik der evolutionären Selektion und Adaption des Corrinrings.

Für die Synthese von 5′-Desoxy-5′-adenosylrhodibalamin (AdoRbl) wurden komplementäre chemische und biologische Methoden entwickelt (Abbildung 2). Dazu wurde Hydrogenobyrinsäure-a,c-diamid (Hbad) in vivo mithilfe eines gentechnisch veränderten E.-coli-Stamms de novo synthetisiert, der mit den zehn relevanten Genen (cobA-I-G-J-M-F-K-l-H-B) für die Biosynthese von B₁₂ aus dem endogenen Vorläufer Uroporphyrinogen III ausgestattet war.⁵ Aus 30 L Zellkultur wurden 88.2 mg Hbad erhalten. Rhodibyrinsäure-a,c-diamid wurde aus Hbad mittels chemischer Insertion von Rh^I hergestellt.⁶ Das zunächst isolierte orangerote Dicyanorhodi(III)byrinsäure-a,c-diamid (CN₂-Rhbad)^6b (75 % Ausbeute) ließ sich nicht in Adenosylrhodi(III)byrinsäure-a,c-diamid (AdoRhbad) umwandeln. Die Isolierung des Rhodibyrinsäure-a,c-diamids als Dichlor-Rh^III-Corrinoid (DCRhbad), das mit UV/Vis-Spektroskopie und Massenspektrometrie charakterisiert wurde, machte aber eine Weiterverarbeitung zu AdoRhbad möglich. Die Reduktion von DCRhbad mit Natriumborhydrid in anaerober Lösung führte zu einem hellgelben Rh^I-Corrinoid. Nach Zugabe von 5′-Desoxy-5′-iodadenosin (bei 0 °C, dann Raumtemperatur) erhielt man eine orangerote Reaktionslösung, aus der AdoRhbad in 75 % Ausbeute isoliert wurde. Die Molekülformel von AdoRhbad wurde anhand eines ESI-Massenspektrums bestätigt (m/z [M⁺]=1230.3). Das UV/Vis-Spektrum von AdoRhbad glich jenen der Dichloro- oder Dicyano-Rh^III-Analogen (Abbildung S1 der Hintergrundinformationen). Im ¹H-NMR-Spektrum von AdoRhbad wies die metallgebundene Methylengruppe des 5′-Desoxyadenosyl-Liganden zwei charakteristische Multipletts im Hochfeldbereich auf, die den diastereotopen Protonen dieser CH₂-Gruppe zugeordnet wurden (Abbildung S2). Diese beiden Signale zeigten eine diagnostische 1.7-Hz-Kopplung mit ¹⁰³Rh (I=1/2).

Das Rh-Analog von Adenosylcobyrinsäure-a,c-diamid wurde mithilfe des B₁₂-Biosyntheseenzyms CobQ⁷ spezifisch an vier der verbleibenden fünf Carboxy-Seitenketten amidiert und so in Adenosylrhodi(III)byrsäure (AdoRhby) überführt (Abbildung 2). Tatsächlich verhielt sich AdoRhbad als außerordentlich gutes Pseudosubstrat für CobQ und ergab AdoRhby in 92 % Ausbeute. Die regiospezifische Vierfach-Amidierung der peripheren Seitenketten wurde mit ESI-MS- und ¹H-NMR-Spektren bestätigt.

5′-Desoxy-5′-adenosylrhodibalamin (AdoRbl), das Rh-Analog von Coenzym B₁₂ (AdoCbl), wurde durch chemische Konjugation von AdoRhby mit dem B₁₂-Nukleotidteil hergestellt.^{1a, 8} Dabei wurde AdoRhby mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) aktiviert und mit dem B₁₂-Nukleotidteil zu orangerotem AdoRbl in einer Ausbeute von 79 % umgesetzt. Das UV/Vis-Spektrum von AdoRbl zeigte, wie bereits bekannt,² Absorptionsmaxima bei λ=512, 491 und 350 nm (Abbildung S1). Überraschenderweise hat das Spektrum von AdoRbl große Ähnlichkeit mit dem von Cyanocobalamin (Vitamin B₁₂) und unterscheidet sich signifikant vom Spektrum von Coenzym B₁₂ (AdoCbl). Wie schon früher beschrieben,² ist AdoRbl, im Unterschied zum photolabilen AdoCbl, in aerober wässriger Lösung am Tageslicht stabil.⁹

Im 500-MHz-¹H-NMR-Spektrum von AdoRbl in D₂O traten Signale aller C-gebundenen H-Atome auf, einschließlich der charakteristischen Dublett- und Triplett-artigen Signale der Rh-gebundenen CH₂-Gruppe des Ado-Liganden (Abbildung 3). Dieser Befund steht im frappanten Gegensatz zum früher publizierten Spektrum von AdoRbl, in dem diese Signale nicht auftraten.² Die Hochfeldsignale der diastereotopen Protonen H_AC5RL und H_BC5RL von AdoRbl entsprechen den Signalen von H_re and H_si im Spektrum von AdoCbl, sind aber um δ=1.31 ppm hochfeldverschoben. Die Molekülstruktur von AdoRbl im Kristall zeigt eine antiperiplanare Anordnung von HC4RL und H_re am C5RL, was analog die Zuordnung des Triplett-artigen Signals von H_AC5RL zu H_re stützt. Mithilfe der ¹H,¹H-NOE-Daten (Abbildungen S3 und S4) konnten die “Base-on”-Konstitution von AdoRbl und die Verknüpfung des 5′-Desoxyadenosylteils auf der β-Seite des Corrin-gebundenen Rh-Zentrums nachgewiesen werden. Die 2D-NMR-Daten lieferten chemische Verschiebungswerte (z. B. der Protonen der Seitenketten des Rings B; Tabellen S1–S3), die für AdoRbl und AdoCbl eine ähnliche Konformation des Corrinliganden und der axialen Gruppen anzeigten. AdoRbl und Coenzym B₁₂ (AdoCbl)¹⁰ haben also in wässriger Lösung sehr ähnliche Strukturen.

AdoRbl kristallisierte als dunkelrote monokline Prismen (Raumgruppe C2, Nr. 5) aus Wasser/Acetonitril. Die Analyse der Kristalle von AdoRbl ergab eine hochaufgelöste Röntgenkristallstruktur, die erste eines Metallanalogs der Cobalamine. Sie bestätigte die aus NMR-Daten abgeleitete chemische Konstitution von AdoRbl und zeigte grob dieselben Strukturmerkmale wie die Struktur von AdoCbl¹¹ (Abbildungen 4 und S6). Wie bei AdoCbl ist die Ado-Gruppe von AdoRbl über dem Ring C des Corrinrings positioniert. Allerdings ist sie im Fall von AdoRbl um 24° gegen den Uhrzeigersinn gedreht (Abbildung S7) und ist dort über eine für ein Cbl neuartige Dimerisierungs-Grenzfläche stabilisiert, die den Ado-Teil und beide Seitenketten des Rings B über H-Bindungen verknüpft (Abbildung S9). Die Ado-Gruppe von AdoRbl ist damit näher zum Ring B orientiert (verglichen zur Position in AdoCbl),¹¹ und Ring B nimmt eine in Cbl unbekannte Konformation ein, wie unten weiter diskutiert.

Die biologische Aktivität von AdoRbl als AdoCbl-Analog wurde zunächst in einem mikrobiellen Methionin-Synthase(MetH)-Bioassay getestet,¹² wie auch anschließend in einem direkten Enzymassay mit Propandiol-Dehydratase (PduCDE). Um die Aktivität von AdoRbl in MetH zu untersuchen, verwendeten wir einen Salmonella-enterica-cobB-metE-Reporterstamm, der für sein Wachstum in minimalem Medium auf exogenes Cbl angewiesen ist. Dabei spiegelt die Größe der Wachstumskreise auf den Agarplatten die aufgetragene Menge an Cbl logarithmisch wider (Abbildung 5).

Die Zugabe von AdoRbl alleine führte zu keinem Wachstum auf den Bioassayplatten. Nach dem Auftragen von AdoRbl in kurzer Entfernung zu einer identischen Menge CNCbl bildete sich eine Inhibitionszone um die Stelle, an der AdoRbl aufgetragen wurde. Diese vergrößerte sich durch Erhöhung der AdoRbl-Konzentration (Abbildung 5). Unerwarteterweise kam es zur Bildung von größeren, aber diffuseren Wachstumskreisen beim Auftragen einer Mischung von CNCbl und AdoRbl. Diese Befunde zeigen erstens, dass AdoRbl nicht in einen aktiven Cofaktor überführt wird, und zweitens, dass AdoRbl die Aufnahme von Cbl verhindert oder mit Cbl um die Bindungsstelle in MetH konkurriert und so als Inhibitor fungiert. Eine plausible Erklärung für die Vergrößerung der Wachstumskreise beim Mischen von CNCbl mit einem Überschuss an AdoRbl ist die Fähigkeit des Analogs, aktiv mit der Regulierung der Cbl-Aufnahme über einen B₁₂-RNA-Schalter¹³ zu wechselwirken. In E. coli und S. enterica reduziert der B₁₂-RNA-Schalter btuB^{13, 14} nach Anlagerung seines hochaffinen Liganden AdoCbl und über eine Rückkopplungsregelung die Produktion des an der Außenmembran aktiven B₁₂-Transporters. Die vergrößerten Wachstumskreise lassen damit auf eine Reduktion der Aufnahme von Cbl durch AdoRbl schließen.

Die Wirkung von AdoRbl auf die Aktivität von AdoCbl-abhängigen Enzymen wurde am Beispiel der 1,2-Propandiol-Dehydratase von Citrobacter freundii analysiert (Abbildungen S10–S12). Die kinetischen Konstanten der Reaktion mit gereinigter 1,2-Propandiol-Dehydratase wurden mittels nichtlinearer Regression bestimmt. Mit AdoRbl als AdoCbl-Ersatz konnte keine Enzymaktivität festgestellt werden. Im Unterschied dazu war das Enzym mit AdoCbl aktiv und ergab K_m=3.0 μm und k_cat=358 s⁻¹ (basierend auf einer α₂β₂γ₂-Quartärstruktur). In weiterführenden Experimenten wurde gezeigt, dass AdoRbl wie auch Vitamin B₁₂ kompetitive Inhibitoren des Enzyms sind, mit K_i=6.9 μm für AdoRbl und 2.5 μm für Vitamin B₁₂. Diese Befunde bestätigen, dass AdoRbl nicht in der Lage ist, die AdoCbl-abhängige Propandiol-Dehydratase-Reaktion zu katalysieren, und als Inhibitor dieses Enzyms wirkt.

Die biologischen Rollen von Cobalt¹⁵ wie auch der funktionellen Formen von B₁₂¹⁶ scheinen gegenseitig weitgehend abhängig und bemerkenswert exklusiv zu sein. Die Frage, warum Cobalt und kein anderes Übergangsmetall in B₁₂ gefunden wird, hat somit das Interesse an B₁₂-Metallanalogen geweckt. In diesem Zusammenhang kommt dem Gruppe-IX-Element Rhodium ein außerordentlicher Stellenwert zu. Wir haben deshalb 5′-Desoxy-5′-adenosylrhodibalamin (AdoRbl) synthetisiert, aufbauend auf einer strategischen Anwendung einer präzisen Sequenz biologischer und chemischer Schritte. Die erwartete große Strukturähnlichkeit von AdoRbl zu AdoCbl wurde durch Strukturanalysen in Lösung (NMR) und im Kristall bestätigt. Die Kristallstruktur von AdoRbl zeigte aber auch interessante Konsequenzen des Ersatzes von Co^III durch das größere Rh^III in AdoRbl auf. Wie aufgrund des um 0.06 Å größeren Kovalenzradius von Rh¹⁷ erwartet, sind alle sechs Bindungen zum Metallzentrum von AdoRbl länger als bei AdoCbl. Bei genauerer Betrachtung sind die vier äquatorialen Bindungen aber um 0.082(5) Å verlängert, die axialen Bindungen nur um 0.035(5) Å (Abbildung 6).

Mit einem Faltungswinkel von rekordmäßig nur 5.9(2)° ist außerdem der Corrinring von AdoRbl ungewöhnlich flach (vgl. 13.3° in AdoCbl; siehe Abbildungen 7, S8 und S9).¹⁸ Der Ring B von AdoRbl erfährt gegenüber den Strukturen von AdoCbl und anderer Cbl ebenfalls eine starke Einebnung und weist eine invertierte konformative Verdrillung auf. Die Acetamid- und Propionamidsubstituenten am Ring B sind nun beide in einer pseudo-äquatorialen Position angeordnet. In der Lösung nimmt der Ring B von AdoRbl aber dieselbe Konformation ein wie der von AdoCbl,¹⁰ und es gibt keine Hinweise auf die im Kristall auftretende “invertierte” Verdrillung. Tatsächlich ist der Ring B von AdoRbl damit wohl als flexibel einzuschätzen, und seine invertierte Konformation im Kristall ist der dort auftretenden Dimerisierung über H-Bindungen zu verdanken.

Der Vergleich der Strukturen von AdoRbl und AdoCbl zeigt erstaunlicherweise, dass das größere Rh^III-Ion besser in den Corrinliganden passt als das biologisch relevante Co^III-Ion. Eschenmoser und Kratky haben die fundamentalen strukturellen Konsequenzen von zu kleinen koordinierten Metallionen (z. B. Low-Spin-Ni^II) in Tetrapyrrolmakrocyclen untersucht.^{1a, 19} Sie folgerten, dass eine Verkleinerung des Makrocyclus zu einer korrelierten konformativen Adaption der vier Pyrrolringe führt und so zu nicht planaren (sondern “sattelförmigen”) Porphyrinen. Ähnliche konformative Effekte infolge der Anpassung des Koordinationsraums an das gebundene Metallion wurden in zahlreichen porphyrinoiden Metallkomplexen beobachtet,²⁰ wo der Einfluss der Porphyrindeformation auf die biologische Aktivität von Interesse ist.²¹

Die Kristallstruktur von AdoRbl lässt darauf schließen, dass der Koordinationsraum des Corrinliganden ein wenig zu groß für die Koordination von Co^III-Ionen ist. Daraus resultiert sowohl die prägnante Faltung der natürlichen Co^III-Corrinoide (13.3° in AdoCbl) als auch die deutliche Verdrillung der Pyrrolringe²² (Abbildung S8). Letztere ist im konformativ “in Phase” verdrillten Ring B am deutlichsten.^{1a, 22a} Im Unterschied dazu kommt es durch die Koordination des größeren Rh^III-Ions in AdoRbl, wie in der Kristallstruktur ersichtlich, zu einer konformativen Entspannung des Corrinliganden.

Die Natur hat die einzigartige “konstitutionelle Ringkontraktion” des Corrinliganden^{1a, 23} entwickelt, um den Koordinationsraum zu verkleinern und so Cobalt zu beherbergen.²⁴ Die hier beschriebenen Untersuchungen deuten darauf hin, dass es noch zu einer zusätzlichen konformativen Adaption des Corrinliganden kommt, um ein Co^III-Ion zu binden. Die hier gemachte Entdeckung, dass Rh^III besser in den Corrinliganden passt als das biologisch relevante Co^III, lässt uns schließen, dass der Corrinligand von der Natur nicht primär für Co^III entworfen wurde. Da Rhodium kein essenzielles Element für Leben auf der Erde ist,¹⁵ sollte unser Augenmerk der Wechselwirkung des Corrinringes mit Cobalt gewidmet sein, etwa mit seinen reduzierten Formen, Co^II und Co^I. AdoCbl und Cob(II)alamin weisen sehr ähnliche Cobaltcorrinstrukturen auf,²⁵ doch bis heute gibt es keine kristallographischen Daten zur Struktur von Co^I-Corrinen (siehe z. B. Lit. ^16a). Es wurde berechnet, dass eine Vergrößerung des Koordinationsraums des Corrinliganden die Reduktion von Co^III- und von Co^II-Corrinen zu unterstützen vermag.²⁶ Deshalb ist es naheliegend vorzuschlagen, dass der Corrinligand genau dem polarisierbaren Co^I-Ion angepasst ist, das ja das Reaktionszentrum der rätselhaften, “supernukleophilen” Co^I-Corrine ist, und es stabilisiert.^{1b, 16a},^{16b, 27} In Analogie zur Vorstellung, dass sich Enzyme zwecks Stabilisierung von Übergangszuständen und Absenkung der Aktivierungsenergie von Reaktionen entwickelt haben,²⁸ wäre die vorgeschlagene Fähigkeit des Corrinliganden, den Co^I-Zustand gegenüber den Co^III- und Co^II-Formen zur stabilisieren, ein essenzieller Aspekt für Reaktionen mit Co^I-Corrin-Zwischenprodukten,^{26, 27, 29} die ja in biologischer Umgebung sehr schwer zugänglich sind.^{14, 29} Eine solche Fähigkeit hätte es ermöglicht, die Selektion der B₁₂-Struktur fein auf seine Rolle als essenzieller, metallorganischer Katalysator in der präbiotischen Chemie des Lebens abzustimmen.³⁰ Dies ist in Einklang mit dem Vorschlag, dass Cobaltcorrine bereits als urzeitliche Cofaktoren fungiert haben.^1a

Das Rezept für die Biosynthese von Coenzym B₁₂ (AdoCbl) ist nur in den Genomen gewisser Prokaryoten kodiert.³¹ Durch seine Verwendung in einem gentechnisch veränderten E.-coli-Stamm wurde ein effizienter biologisch-chemischer Syntheseweg zu AdoRbl zugänglich. AdoRbl wurde als strukturelles, aber nicht funktionelles Analog des B₁₂-Coenzyms AdoCbl charakterisiert. Die Inaktivität als Coenzym und die inhibitorische Wirkung des weitgehend isostrukturellen Rh-Analogs von AdoCbl lassen auf eine ineffiziente Homolyse der Rh-C-Bindung des enzymgebundenen AdoRbl schließen. Die experimentelle Bestimmung der Stärke der Rh-C-Bindung (siehe Lit. ³²) wird Aufschluss über die Richtigkeit dieser Annahme geben.

Nachdem wir die fundamentale Frage “Warum Cobalt?”¹ aufgegriffen haben, sollten wir nun vielleicht fragen: “Warum nicht Rhodium oder ein anderes Metall?”. Metallanaloge von Cobalaminen (Metbalamine) gelten, wie auch die Studie von AdoRbl gezeigt hat, als inaktive Cofaktoren. Tatsächlich wurde schon früher gezeigt, dass einige Metbalamine Bakterien-Wachstum hemmen.⁶ In geeigneter Weise strukturierte Metbalamine könnten also effektive B₁₂-Antimetaboliten oder “Antivitamine B₁₂” sein,³³ die im Hinblick auf kürzlich entdeckte neuartige biologische Funktionen von Cbl³⁴ von wachsendem Interesse sein werden. Unser konzertierter biologisch-chemischer Synthesezugang zum “Rhodium-Problem” hat ein neues Tor zur Herstellung von Metbalaminen und Metallocorrinoiden aufgestoßen, einem spannenden, doch kaum erforschten Gebiet im facettenreichen B₁₂-Feld.