Physicochemical properties and release characteristics of growth factor-modified calcium phosphate bone cement
Abstract
enThe addition of growth factors, such as recombinant human transforming growth factor-β1 (rhTGF-β1) to calcium phosphate cements (CPCs) may improve bone regeneration. Previously we have shown that the differentiation of pre-osteoblastic cells from adult rat long bones was stimulated by rhTGF-β1 in CPC. CPC that was intermixed with rhTGF-β1 and then applied in rat calvarial defects enhanced bone growth around the cement and increased the degradation of the cement. It is still unknown however whether the addition of rhTGF-β1 changes the material properties of the CPC, and what the release characteristics are of rhTGF-β1 from the CPC. We therefore determined here the release of rhTGF-β1 in vitro from the cement pellets as implanted in the rat calvariae. The possible intervening effects of rhTGF-β1-intermixing on clinical compliance of CPC were studied by assessing its compressive strength and setting time, as well as crystallinity, calcium to phosphorus ratio, porosity and microscopic structure.
CPC was prepared by mixing calcium phosphate powder (58% α-tricalcium-phosphate, 25% dicalcium-phosphate anhydrous, 8.5% calcium-carbonate and 8.5% hydroxyapatite), with liquid (3 g/ml). The liquid for standard CPC consisted of water with 4% sodium hydrogen phosphate, while the liquid for modified CPC, was mixed with an equal amount of 4 mM hydrochloride with 0.2% bovine serum albumin. The hydrochloride liquid contained the rhTGF-β1 in different concentrations for the release experiments.
Most of the incorporated rhTGF-β1 in the cement pellets was released within the first 48 hr. Approximately 0.5% rhTGF-β1 (intermixed at 100 ng to 2.5 mg/g CPC) was released within the first 4 hr increasing to 1% after 48 hr. rhTGF-β1 release continued at 0.1% up to at least 8 weeks. Modification of CPC slightly increased the initial setting time at 20°C from 2.6 to 5 min, but did not affect the final setting time of the CPC at 20°C, nor the initial and final setting time at 37°C. The compressive strength was increased from 18 MPa (standard CPC) to 28 MPa (modified CPC) only at 4 hr after mixing. The compressive strength diminished in the modified CPC between 24 hr and 8 weeks from 55 to 25 MPa. X-ray diffraction revealed that both standard and modified CPC changed similarly from the basic components, alpha-tri-calcium phosphate and dicalcium phosphate anhydrous, into an apatite cement. The calcium to phosphorus ratio as determined by an electron microprobe did not differ for standard CPC and modified CPC. Standard and modified CPC became a dense and homogeneous structure after 24 hr, but the modified CPC contained more crystal plaques compared to the standard CPC, as observed by scanning electron microscopy (SEM). SEM and back scattered electron images revealed that after 8 weeks both cements showed an equally and uniform dense structure with microscopic pores (less than 1 μm). Both CPCs showed fewer crystal plaques at 8 weeks than at 24 hr.
This study shows that the calcium phosphate cement was not severely changed by modification of the CPC for rhTGF-β1. Clinical handling may be affected by the prolonged setting time of modified cement, but it is still within preferable limits. Compressive strength was for both standard and modified cements within the range of thin trabecular bone, and therefore both CPCs can withstand equal mechanical loading. The faster diminishing compressive strength of modified cement (from 24 hr to 8 weeks) likely results in early breakdown, and therefore might be favourable for bone regeneration. Together with our previous studies showing the beneficial effects of adding rhTGF-β1 to CPC on bone regeneration, we conclude that the envisaged applications for CPC in bone defects are upgraded by intermixing of rhTGF-β1. Therefore the combination of CPC with rhTGF-β1 forms a promising synthetic bone graft.
Abstract
dePhysikochemische Eigenschaften und Freisetzungscharakteristiken von wachstumsfaktorenhaltigem Calcium-Phosphat-Zement
Der Zusatz von Wachstumsfaktoren, wie z. B. rekombinantem humanen “transforming growth faktor-β1 (rhTGFβ1), zu Kalziumphosphat-Knochenzement (CPC) könnte die Regeneration von Knochen beschleuningen. In früheren Untersuchungen konnten wir zeigen, dass rhTGFβ1 aus CPC die Differenzierung von Prä-Osteoblasten aus langen Knochen der Ratte fördert. rhTGFβ1, das mit CPC vermischt bei Ratten in Kalvariendefekte eingebracht worden war, verstärkte zudem das Knochenwachstum um den Zement und förderte den Abbau des Zements. Nach wie vor ist jedoch unbekannt, inwiefern der Zusatz von rhTGFβ1 Materialeigenschaften von CPC verändert und wie rhTGFβ1 das Material verlässt. Wir haben daher in vitro die Freisetzung von rhTGFβ1 aus Zement-Pellets bestimmt, wie sie auch für Implantationen in Ratten-Kalvarien benutzt wurden. Die möglichen Auswirkungen einer rhTGFβ1-Beimischung auf die klinische Eignung von CPC wurden im Hinblick auf die Druckfestigkeit, die Absetzdauer, die Kristallinität, das Kalzium-Phosphor-Verhältnis, die Porosität sowie die mikroskopische Struktur untersucht.
Zur Herstellung von CPC wurde Kalziumphosphat-Pulver (58% α-Trikalziumphosphat, 25% Dikalziumphosphat (wasserfrei), 8,5% Kalziumkarbonat und 8,5% Hydroxylapatit) mit Flüssigkeit vermischt (3 g/ml). Für den Standard-CPC bestand diese Flüssigkeit aus Wasser plus 4% Natriumhydrogenphosphat; bei einem modifizierten CPC wurden 4 mM Hydrochlorid und 0,2% Rinderserumalbumin zugesetzt. Die Hydrochlorid-Flüssigkeit enthielt dabei für die Freisetzungsexperimente rhTGFβ1 in unterschiedlichen Konzentrationen.
Das meiste rhTGFβ1 wurde innerhalb der ersten 48 h aus den Zement-Pellets freigesetzt: Ungefähr 0,5% des eingeschlossenen rhTGFβ1 (100 ng vermischt mit 2.5 mg/g CPC) wurde während der ersten 4 h frei, 1% wurde insgesamt während der ersten 48 h herausgelöst. Die rhTGFβ1-Freisetzung von weiteren 0,1% dauerte mindestens 8 Wochen an. Die Modifikation des CPC erhöhte die initiale Absetzdauer bei 20°C von 2,6 auf 5 min, hatte aber weder Einfluss auf die finale Absetzdauer bei dieser Temperatur, noch auf die initiale oder terminale Absetzdauer bei 37°C. Die Druckfestigkeit des modifizierten PCP war 4 h nach dem Zusammenmischen von 18 MPa (Standard PCP) auf 28 MPa erhöht. Sie verminderte sich im modifizierten CPC über einen Zeitraum von 48 h bis zu 8 Wochen von 55 auf 25 MPa. Röntgenbeugungsanalysen zeigten, das sich Standard CPC und modifiziertes CPC im Hinblick auf die Basiskomponenten α-Trikalziumphosphat und Dikalziumphosphat (wasserfrei) in ähnlicher Weise in Apatit-Zement umwandelten. Das mit der Röntgenmikrosonde bestimmte Kalzium-Phosphor-Verhältnis unterschied sich nicht. Standard CPC und modifiziertes CPC erhielten nach 24 h jeweils eine dichte und weitgehend homogene Struktur, wenngleich das modifizierte CPC mehr kristalline Plaques enthielt, was mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) untersucht wurde. SEM und Bilder, die mittels rückgestreuter Elektronen aufgenommen wurden, zeigten, dass beide Zementarten eine gleichförmig dichte Struktur mit kleinen (< 1 μm) Poren aufwiesen. Beide CPCs wiesen nach 8 Wochen weniger kristalline Einschlüsse auf als nach 24 h.
Die Untersuchungen zeigen, dass Kalziumphosphat-Zement durch die Beimischung von rhTGFβ1 zum CPC nicht nachhaltig verändert wird. Die klinische Handhabung könnte zwar wegen der verlängerten Absetzdauer beeinträchtigt sein, bleibt jedoch innerhalb geeigneter Grenzen. Die Druckfestigkeit war für beide Zementsorten im Bereich des trabeculären Knochens, weshalb beide CPCs einer mechanischen Belastung gleichermaßen standhalten können. Die beschleunigte Abnahme der Druckfestigkeit des modifizierten Zements (von 24 h bis 8 Wochen) trägt wahrscheinlich zum schnelleren Abbau bei und könnte daher förderlich für die Knochenregeneration sein. Aus diesen und unseren vorhergehenden Untersuchungen zum positiven Effekt von rhTGFβ1 auf die Knochenregeneration schließen wir, dass die angestrebte Anwendung von CPC bei Knochendefekten durch den Einsatz von rhTGFβ1 aufgewertet wird. Die Kombination von CPC mit rhTGFβ1 ergibt daher einen vielversprechender synthetischer Knochenersatzstoff.
